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3. DISKUSSION 98

Zum Vergleich der Eigenschaften der in verschiedenen Mikroorganismen exprimierten ROL

und ProROL wurde die gereinigte reife ROL aus E. coli (hergestellt nach: (Beer 1994, Beer,

et al. 1998) mit der im Schüttelkolben kultivierten und ebenfalls gereinigten ROL aus Pichia

pastoris mit Daten aus der Literatur verglichen.

In der SDS PAGE zeigten die rekombinaten ROL aus Pichia pastoris und E. coli ein nahezu

identisches Laufverhalten, entsprechend einer Molmasse von ca. 30 kDa (Beer, et al. 1998),

das der für die native RDL, bzw. für die rekombinante RDL aus E. coli beschriebenen ent-

spricht (Haas, et al. 1992, Joerger und Haas 1993). Durch die Klonierung in Pichia pastoris

wurden zwei zusätzliche Aminosäuren eingeführt, weshalb diese geringfügig schwerer ist.

Der möglicherweise glykosylierten nativen Lipase aus der Kultivierung von Rhizopus oryzae

wurde von Ben Salah et al. eine Bande im SDS Gel bei 32 kDa zugeordnet (Ben Salah, et al.

1994).

Die Deglykosylierung der Lipase aus Pichia pastoris zeigte aus der Kultivierung im Schüttel-

kolben, daß, obwohl drei mögliche N-Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) vorliegen, hier

keine Glykosylierung erfolgte. Bei der Kultivierung im Fermenter hingegen scheint ein klei-

ner Anteil der Lipase glykosyliert zu werden, da bei ca. 32 kDa eine Bande auftritt, die bei

Inkubation mit Endo H verschwindet (Serrano, persönliche Mitteilung). Eine partielle

Glykosylierung in Pichia pastoris wurde schon für die Expression des ankerlosen Ober-

flächenantigens 1 (Surface antigen; SAG1) aus Toxoplasma gondii beschrieben (Biemans, et

al. 1998), jedoch nicht erklärt. Dies ist auch schwierig, insbesondere deshalb, weil andere

Lipasen aus Pilzen wie z. B. der Lipase aus Candida rugosa (Lip 1) (Brocca, et al. 1998) bzw.

der Lipase aus Geotrichum candidum (Lip A u. B) (Catoni, et al. 1997), vollständig glykosy-

liert exprimiert wurden. Da jedoch bei der Kultivierung im Schüttelkolben keine, zumindest

im SDS Gel detektierbare Glykosylierung auftritt, könnte der Expressionslevel entscheidend

für das Auftreten von glykosyliertem Protein sein.

Weder der isoelektrische Punkt der rekombinanten ROL aus E. coli noch der aus P. pastoris

konnte mit der vorhandenen Ausrüstung genau bestimmt werden. Die Bande der Lipase liegt

oberhalb des Maximalwertes von 9,3. Damit unterscheiden sich die rekombinanten Lipasen

vom Wildtyp (RDL) für den ein isoelektrischer Punkt von 8,6 berichtet wurde (Haas, et al.

1992) und von dem theoretisch berechneten Wert von 8,3 (Bornscheuer, et al. 1999). Eine

Übersicht der wichtigsten Eigenschaften der ProROL und ROL exprimiert in verschiedenen

Mikroorganismen zeigt Tabelle 3.2.

1 2 ... 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 ... 152 153

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