Bosch PPS8 C2 Series Uživatelský manuál Strana 65

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2. ERGEBNISSE 64
Die ROL verfügt über einen hohen isoelektrischen Punkt von ca. 9,3. Deshalb sollte die wei-
tere Reinigung über Kationenaustauschchromatographie mit SP-Sepharose als nächstem
Schritt erfolgen.
Abbildung 2.14: Vergleich der Arbeitsschritte bei der Kultivierung von ROL in P.
pastoris und E. coli.
In dem Schema nicht berücksichtigt sind diverse Konzentrierung- und
Dialyseschritte, die bei beiden Methoden notwendig sind.
Die FPLC-Säule (5 x 30 cm) wurde mit SP-Sepharose gepackt, die Säule mit 10 mM CaCl
2
äquilibriert und die Lipaselösung aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit dem
Äquilibrierungspuffer wurde die Lipase mit einem NaCl Gradienten eluiert. Dabei stellte sich
heraus, daß die ROL so stark an das Material bindet, daß sie erst bei der maximalen
Konzentration von 1 M l
-1
von der Säule eluiert wurde (Abbildung 2.15).
500 ml
Kultur
E. coli
Zellpellet
Isolation von
Inclusion bodies
P. pastoris
Überstand
Rückfaltung
Ionenaustausch-
Chromatographie
Ionenaustausch-
Chromatographie
Homogenes Protein
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