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5. MATERIAL & METHODEN 129

gefärbte Gel wurde in eine Entfärbelösung (Methanol (30 % (v/v), Eisessig (10 % (v/v)) über-

führt und solange inkubiert, bis der Hintergrund farblos wurde und die Proteinbanden deutlich

hervortraten.

5.7.1.1.2 Silberfärbung

Phast Gele wurden im PHAST-System automatisch gefärbt. Die Lösungen wurden analog

Butcher angesetzt (Butcher und Tomkins 1986).

5.7.1.1.3 Lipase Aktivitätstest auf SDS PAGE

Die Lipase wurde im Gel durch Inkubation in einer Renaturierungslösung (Tris-HCl (0,1 M;

pH 7,5), Triton X-100 (0,5 % (w/v)); 30 Min.) renaturiert. Die Gele wurden danach ca. 30

Minuten (abhängig von der Aktivität) in einer Färbelösung (1-Naphtylacetat (20 mg) gelöst in

5 ml Aceton, gemischt mit 50 mg Fast Red TR gelöst in 45 ml Tris-HCl (0,1 M; pH 7,5))

inkubiert.

5.7.2 Blotten von Proteinen und N-terminale Proteinsequenzierung

Zum Blotten von Proteinen wurde zuerst eine SDS-PAGE (siehe 5.7.1.1) durchgeführt. Das

Gel wurde danach jedoch nicht gefärbt, sondern 15 Min. in Kathodenpuffer (Tris-HCl (25

mM), Methanol 10 % (v/v); pH 9,4) äquilibriert. In dieser Zeit werden drei Filterpapiere der-

selben Größe vorbereitet und 7 Min. in den folgenden Lösungen inkubiert:

- Filterpapier 1 in Anodenpuffer 1 (Tris-HCl (0,3 M), Methanol (10 % (v/v); pH 10,4)

- Filterpapier 2 in Anodenpuffer 2 (Tris-HCl (25 mM), Methanol (10 % (v/v); pH 10,4)

- Filterpapier 3 in Kathodenpuffer (Tris-HCl (25 mM), Methanol (10 % (v/v); pH 9,4).

Die PVDF-Membran wurde ebenfalls auf die Größe des Gels zugeschnitten und erst kurz in

Methanol (100 %) gespült. Danach wurde sie für 2-3 Minuten in Anodenpuffer 2 (Tris-HCl

(25 mM), Methanol (10 % (v/v), pH 10,4) inkubiert.

Die verschiedenen Filterpapiere, die Membran und das Gel wurden in Form eines Sandwiches

in folgenden Reihenfolge in der Blotting-Kammer (unten Anode, oben Kathode) über-

einandergelegt: 1. Filterpapier 1; 2. Filterpapier 2; 3. PVDF Membran; 4. SDS-PAGE Gel; 5.

Filterpapier 3.

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