Bosch PPS8 C2 Series Uživatelský manuál Strana 44

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2. ERGEBNISSE 43
500
1000
15002000
2500
3000
3500
PPICZ
α
A
3593 bps
SacI
HindIII
EcoRI
SacII
NotI
XbaI
BamH
5´AOX1
α
-
factor
his-tag
ColE1
SmaI
Zeocin
PGAPZ
α
A
3147bps
500
1000
1500
2000
2500
3000
BglII
BspHI
EcoRI
NotI
BamH
SmaI
XmaI
GAP
α-factor
his-tag
AOX1
Zeocin
ColE1
Abbildung 2.2: Schaukelvektoren für Pichia pastoris und E. coli zur Expression von
heterologen Proteinen in Pichia pastoris.
Beide Plasmide enthalten das Shl Ble Gen (Zeocin-Resitenz) zur Selektion
positiver Transformanten gegen das Antibiotikum Zeocin in E. coli und
Pichia pastoris, sowie den α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae zur
Sekretion der Lipase. Zur Replikation und dem Verbleib des Plasmids in
E. coli besitzen beide Vektoren eine Region aus dem pUC-Vektor. Sie
unterscheiden sich durch die verwendeten Promotoren zur heterologen Gen-
expression, im Fall pPIC der induzierbare Promotor der Alkoholoxidase I,
im Fall von pGAP der konstitutive Promotor der Glyceraldehyd-3-
phosphatdehydrogenase.
Die erhaltenen Fragmente wurden aus dem Gel extrahiert und ligiert. Nach der erfolgreichen
Transformation in E. coli wurden einzelne Klone selektiert und die ROL kodierende Gen-
sequenz ebenso wie deren korrekte Fusion an den α-Faktor aus S. cerevisiae durch DNA-
Sequenzierung in 5´ 3´, sowie 3´ 5´ Richtung überprüft. Je ein fehlerloser Klon wurde
ausgewählt (pPICZαA_ROL bzw. pGAPZαA_ROL) und zur Transformation in Pichia
pastoris verwendet.
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