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5. MATERIAL & METHODEN 133

5.9.1 Metallaffinitätschromatographie (Ion Metal Affinity Chromatography, IMAC)

Das Säulenmaterial (20 ml Chelating Sepharose Fast Flow, (Pharmacia, Freiburg)) wurde in

eine Säule mit dem Innendurchmesser von 16 mm gegossen. Zwei peristaltische Pumpen

wurden eingesetzt um einen kontinuierlichen Fluß an Puffern der gewünschten Konzentra-

tionen zu gewährleisten. Die Signale des UV-Detektors (LKB UV-MII) wurden von einem

Schreiber (LKB RIC 102) aufgezeichnet. Einzelne Fraktionen wurden von einem Fraktions-

sammler (LKB FRAC-200) gesammelt (alles Pharmacia, Freiburg).

Das Säulenmaterial wurde mit 3 Säulenvolumen dH

O äquilibriert und dann mit 3 Säulen-

volumen Metall-Lösung (in der Regel Nickelchlorid (0,3 M)) beladen. Das Säulenmaterial

wurde daraufhin mit 3 Säulenvolumen IMAC-Puffer (Natriumphosphat (50 mM; pH 7,5),

NaCl (250 mM)) gewaschen und äquilibriert. Die vorbereitete Probe (1 ml) wurde über eine

Probenschleife auf die Säule aufgebracht und mit einer Flußrate von 1,5 ml min

-1

mit 4

Säulenvolumen IMAC Puffer gewaschen. Zur Elution wurde ein linearer Gradient (0,5 %

Imidazol (0,5 M) in IMAC Puffer pro ml Puffer) verwendet. Um stark bindende Proteine zu

lösen, wurde die Säule abschließend mit 3 Säulenvolumen Imidazol-Lösung (0,5 M) eluiert.

Die Säule wurde mit EDTA (50 mM) und NaCl (1 M) regeneriert, um das Metall und

eventuell noch bindende Proteine und Zellreste zu entfernen.

5.10 Aktivitätstests

5.10.1 Lipase Assays

5.10.1.1 pH-Stat Assay

Die Aktivität der ROL wurde normalerweise mit Triolein als Substrat in einem pH Stat

(Metrohm) bestehend aus Dosimeter 665, Rührer 649, pH-Meter 620 und Impulsomat 614

gemessen. Triolein (20 mM) wurde mit Gummi Arabicum (2% (w/v)) in einem Ultraturrax

(T25, Janke & Kunkel) gut durchmischt (7 Min.), bevor zu der entstandenen Emulsion CaCl

x 2 H

O-Lösung (0,5 % (w/v)) zugegeben wurde. Von dieser Mischung wurden 20 ml in die

Reaktionskammer gefüllt und auf die gewünschte Temperatur (meist 30 °C), sowie auf den

gewünschten pH (meist 8,1), eingestellt. Nach der Zugabe von 25-100 µl Lipaselösung wurde

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