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5. MATERIAL & METHODEN 120

5.6.1.2 Isolierung von DNA mit Anionentauscher-Säulen (Qia Spin-Prep)

Um eine höhere DNA Qualität z. B. für die Sequenzierung zu erhalten, wurde das Qiagen-Kit

"Prepspin Plasmid Isolierung" analog der Empfehlung von Qiagen verwendet. In diesem wird

die DNA ebenfalls nach der Methode der alkalischen Lyse isoliert. Nach der Fällung der

Proteine und Zelltrümmer wird die Plasmid-DNA durch eine Säulenchromatographie an

Anionentauscher Säulen von in der Lösung verbliebener genomischer DNA und RNA abge-

trennt und zum Schluß von der Säule eluiert.

5.6.2 Ethanol-Präzipitation von Plasmid DNA

Die DNA enthaltende Lösung wurde mit 1/10 des Volumens Na-Acetat Lösung (3 M, pH 5,3)

gemischt und 3 Volumen Ethanol (100 %, -20 °C) zugegeben. Die Präzipitation erfolgte 30

Minuten auf Eis. Nach Zentrifugation (14000 U min

-1

, Eppendorf 5417R, 4 °C) wurde der

Überstand entfernt und das verbliebene Pellet mit Ethanol (70 %, -20 °C) gewaschen. Nach

dem Abgießen der Waschlösung wurde die DNA im Vakuum getrocknet und in dH

resuspendiert. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C.

5.6.3 Elektrophoretische Trennung von DNA und Fragmentisolierung

Die Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese erfolgte analog Sambrook 1989

(Sambroock, et al. 1989). Es wurden 1 % Agarosegele in TAE-Puffer (Tris-HCl (40 mM),

Essigsäure (20 mM), EDTA (2mM) pH 8,3) verwendet. Dieser diente auch als Laufpuffer.

Das Gel wurde in einen, mit einem Kamm versehenen, horizontalen Gelträger gegossen. Der

Kamm wird nach dem Auspolymerisieren der Agarose aus dem Gel gezogen und die DNA-

Lösung mit einem Auftragungspuffer (Bromphenolblau (0,1 % (w/v), Glycerin 50 % (v/v)

EDTA (0,5 M, pH 8,0)) vermischt in die entstehenden Probentaschen gefüllt. Durch Anlegen

einer konstanten Spannung von 120 V wandert die DNA durch das Gel. Die DNA wurde mit

der Hilfe von Ethidiumbromid gefärbt, das sich in die Helix interkaliert und im UV-Durch-

licht eines Transilluminators bei 312 nm sichtbar gemacht und photographiert werden konnte.

Größen und Konzentrationsbestimmung erfolgten durch Vergleich mit einem kommerziellen

Standard (Fa. Gibco).

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