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5. MATERIAL & METHODEN 134

die Aktivität bestimmt. Die freigesetzten Fettsäuren wurden automatisch gegen 0,01 N NaOH

titriert, um den pH konstant zu halten. Ein Unit (U) wurde definiert als die Menge Enzym, die

1 µmol Fettsäure in einer Minute unter den gewählten Assay-Konditionen freisetzt.

5.10.1.2 pNPP-Schnelltest

Um schnell eine große Menge an Proben z. B. bei der Proteinreinigung testen zu können,

wurde dieser Schnelltest verwendet (Winkler und Stuckmann 1979).

Lösung A besteht aus p-Nitrophenylpalmitat (pNPP, 10 mM) in Isopropanol gelöst. Lösung B

aus Tris-Puffer (100 mM, pH 7,5), Cholat (0,8 % (w/v)) und Gummi Arabicum (1% (w/v)).

Die separaten Lösungen können 2 Wochen bei –20 °C gelagert werden.

Die Reaktionsmischung setzt sich aus 9 Teilen Lösung B und einem Teil Lösung A zu-

sammen und muß immer frisch angesetzt werden. Die zu untersuchende Lösung (50 µl)

wurde in Mikrotiterplatten pipettiert und die Reaktionsmischung (200 µl) zugegeben. Die

durch die Spaltung des Substrats entstehende gelbe Farbe wurde entweder visuell a/jointfilesconvert/483621/bgeschätzt

oder spektrometrisch quantifiziert.

5.10.2 Fluoreszenz Assay

Die Fluoreszenz wurde in einem FluoStar (BMG) in schwarzen Mikrotiterplatten (Nunc) ge-

messen. Die gemessene Fluoreszenz wurde immer auf einen Standard bezogen und in %

dieses Standards als relative Fluoreszenz angegeben.

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