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2. ERGEBNISSE 50

200 Transformanten pro Transformationsansatz und damit die höchste

Transformationseffizienz.

Tabelle 2.1 zeigt eine Zusammenfassung der Eigenschaften der verschiedenen Trans-

formationsmethoden für Pichia pastoris.

2.1.5 Klonierung, Transformation und Expression von ROL in Saccharomyces

cerevisiae

In der Regel sind die Expressionraten von heterolog exprimierten Proteinen in Pichia pastoris

wesentlich höher, als in Saccharomyces cerevisiae. Will man Pichia pastoris jedoch z. B. für

gerichtete Evolution oder Zufallsmutagenese einsetzen, so wird das durch die niedrige Trans-

formationseffizienz und größere Schwierigkeiten bei der Wiederfindung der Gensequenz

durch die Integration in das Genom erschwert. Für diese und vergleichbare Anwendungen

und den direkten Vergleich der Expressionsrate von Saccharomyces cerevisiae mit Pichia

pastoris wurde die für die native ROL kodierende Gensequenz in den Expressionsvektor für

Saccharomyces cerevisiae (pYes) kloniert.

Das Plasmid pPICZαROL diente in diesem Fall als Templat für die PCR. Um das ROL Gen

inklusive des α-Faktors in den Vektor pYes zu klonieren, wurde der Primer

pYes_alpha_bam1 zur Einführung einer BamHI-Schnittstelle am 5´-Ende des α-Faktors und

der Primer ROL_Not2 am 3´-Ende des ROL-Genes verwendet. Das mit den entsprechenden

Enzymen geschnittene PCR Fragment wurde mit den mit denselben Enzymen geschnitten

pYes Vektor ligiert und in E. coli transformiert. Fünf ampicillin-resistente Klone wurden se-

lektiert und sequenziert, um Fehler bei der PCR bzw. bei der Fusion der Gene auszuschließen.

Ein fehlerloser Vektor wurde in Saccharomyces cerevisiae transformiert und auf Selektivagar

ausplattiert. Fünf Klone wurden in Flüssigmedium überführt und kultiviert, um die Lipase-

Expressionsleistung zu untersuchen. Es konnte jedoch im Überstand keine meßbare Aktivität

detektiert werden. Im Folgenden wurde der Überstand ultrafiltriert und das Konzentrat noch-

mals auf Aktivität untersucht. Die gefundene Aktivität lag zwischen 5-10 U ml

-1

. Da dies

weder mit den Ausbeuten in Pichia pastoris noch mit denen in E. coli konkurrieren kann,

wurden die Expressionsversuche mit S. cerevisiae eingestellt.

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