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2. ERGEBNISSE 77

einfaches physikalisches Verfahren zur Quantifizierung verwendet werden, die Fluoreszenz-

spektroskopie. Die Fluoreszenz stimmt über einen weiten Konzentrationsbereich linear mit

der Konzentration des EGFP überein (Abbildung 2.20).

Die lineare Regression der Messpunkte ergab jedoch keine Ursprungsgerade, dies kann durch

das Auftreten von Streulicht bzw. fluoreszierende Komponenten aus dem Zellaufschluß bei

der Messung in Mikrotiterplatten erklärt werden. Fluoreszenz-Werte unter 10000 sind nicht

mehr direkt mit der EGFP Konzentration korrelierbar. Ein weiterer Vorteil des EGFP ist, daß

sich der Betrag der Fluoreszenz auch über einen weiten pH Bereich zwischen 5,5-10 nicht

änderte. Damit ist auch die Elution über einen pH Gradienten mit direkter Analyse der

Fraktionen möglich.

2.4.1.3 Fusion der Random-HeliTag Sequenzen an EGFP

Es wurden die zwei Primer GFP_WHO_1 und GFP_WHO_2, die teilweise mit der Sequenz

des EGFP kodierenden Gens übereinstimmten, für die PCR verwendet. Dabei enthielt der 5´-

terminale Primer GFP_WHO_1 die HeliTag-Sequenz mit den für die sechs variablen und vier

konservierten Aminosäuren (RandomHeliTag) kodierenden Nukleotiden und zusätzlich eine

NcoI-Schnittstelle, mit GFP_WHO_2 wurde eine NotI-Schnittstelle ans 3´-Ende des EGFP

Gens eingefügt. Als Templat für die DNA diente das Plasmid pEGFP (Clontech). Das PCR-

Produkt und der Vektor wurden mit NcoI und NotI geschnitten und nach der Isolation der

entsprechenden DNA-Fragmente durch Gelextraktion ligiert und bildeten die Plasmide

pEGFP HeliTag. Abbildung 2.21 zeigt als Beispiel die mit dem degenerierten Primer

GFP_Wobble_1 zur Einführung der HeliTags mit zufälliger Sequenz und GFP_Wobble_2 zur

Einführung der NotI Schnittstelle am Ende. Der HisTag und der WtHeliTag wurden durch

eine PCR mit den entsprechenden Primern an das EGFP fusioniert und ansonsten analog

weiterverarbeitet.

Die ligierte DNA wurde in E. coli transformiert und Kolonien, die im UV-Licht grüne

Fluoreszenz zeigten, wurden selektiert und in Mikrotiterplatten kultiviert.

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