Bosch PPS8 C2 Series Uživatelský manuál Strana 129

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5. MATERIAL & METHODEN 128
5.7 Arbeiten mit Proteinen
5.7.1 Proteinanalyse
5.7.1.1 SDS-PAGE
Die SDS-PAGE wurde analog Laemmli (Laemmli 1970) durchgeführt. Um Proteine der
Größe zwischen 12 und 68 kDa zu trennen, wurden Gele verwendet, die entweder 10 % (w/v),
12,5 % (w/v) oder 15 % (w/v) Acrylamid enthielten. Normalerweise wurden Gele mit einem
Anteil von 12,5 % (w/v) Acrylamid verwendet. Die Zusammensetzung der Gele und Puffer ist
in Tabelle 5.13 zusammengefaßt.
Tabelle 5.13: Zusammensetzung der für die SDS PAGE benötigten Gele und Puffer
Sammelgel 1,0 ml 4 x Upper Tris (Tris-HCl (0,5 M), SDS (4 % (w/v)), pH 6,8); 0,52
ml Acrylamid (30 %(w/v)); 2,47 ml dH
2
O; 40 µl APS; 8 µl TEMED
Trenngel (12,5 %) 2,0 ml 4 x Lower Tris (Tris-HCl (1,5 M), SDS (4 % (w/v)), pH 8); 3,33
ml Acrylamid (30 %(w/v)); 2,67 ml dH
2
O; 40 µl APS; 8 µl TEMED
SDS-
Probenpuffer
Glycerin (20 % (w/v)), 2-Mercaptoethanol (6 % (w/v)), Bromphenolblau
(0,0025 % (w/v)) gelöst in 1 x Upper Tris
Laufpuffer Tris-HCl (25 mM, pH 8,4), Glycerin (0,192 M), SDS (0,1 %)
Protein-Standard Phosphorylase b (97,4 kDa), Serumalbumin (66,2 kDa), Ovalbumin (45,0
kDa), Carbonsäureanhydrase (31,0 kDa), Trypsin Inhibitor (21,5 kDa)
und Lysozyme (14 kDa)
Alternativ zu den selbst hergestellten wurden die SDS Gele (Gradient 8-25 mit denaturieren-
den Pufferstreifen) von Pharmacia (Freiburg, Deutschland) verwendet. Diese wurden im
PHAST-System (Pharmacia) gefahren und auch in diesem mit Silber gefärbt (siehe 5.7.1.1.2).
5.7.1.1.1 Coomassie Färbung
Das Proteingel wurde 30 Minuten bis 12 h in der Färbelösung (Coomassie Brilliant Blau
R-250 (0,1 % (w/v)), Methanol (30 % (v/v)), Eisessig (10 % (v/v) inkubiert. Das komplett
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