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2. ERGEBNISSE 44

2.1.2 Transformation und Expression der ROL in Pichia pastoris GS 115 (his 4)

Zu Beginn der Arbeit wurde der Pichia pastoris Stamm GS115 verwendet. Dieser auxotrophe

Stamm wurde durch die Deletion des für die Histidinoldehydrogenase kodierenden Gens aus

dem His4 Locus hergestellt, d. h. durch Unterbrechung der Histidin Biosynthese kann er auf

synthetischem Mangelmedium nur durch die Zugabe von Histidin kultiviert werden. Durch

die Verwendung der Vektoren pPICZαA bzw. pGAPZαA mit dem Resistenzgen gegen

Zeocin™ wird jedoch dieses Gens in der Hefe nicht zur Selektion von positiven Trans-

formanten benötigt, verlangt aber den Zusatz von Histidin in synthetischen Medien.

Um die Transformations-Effizienz in Pichia pastoris zu erhöhen wurden die Plasmide mit

SacI, im Falle von pPICZαA_ROL und BspHI im Falle von pGAPZαA_ROL, linearisiert und

nach der Elektroporationsmethode von Invitrogen (siehe 5.5.2.9) in kompetente GS115 Zellen

transformiert.

Transformierte Zellen wurden auf YPDS-Platten mit Zeocin als selektivem Marker ausge-

strichen und drei bis vier Tage bei 30 °C inkubiert. Nach dieser Zeit waren pro Transfor-

mations-Ansatz 5-10 Kolonien auf jeder Platte entstanden.

Kolonien, transformiert mit pPICZαA_ROL wurden auf Tributyrin-Minimalmedium (TMM)-

Platten (YPD-Medium ohne Glukose) transferiert und auf Ihre Fähigkeit ROL zu bilden

untersucht (siehe 2.1.2.1).

Zellen, transformiert mit pGAPZαA_ROL, wurden zur Durchmusterung auf YPD-Platten mit

Tributyrin transferiert (siehe Kapitel 2.1.2.3).

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