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2. ERGEBNISSE 68

Nach der Reinigung durch Ultrafiltration und Ionenaustauschchromatographie zeigten sich

neben der Lipasebande noch ein paar schwächere Banden (Abbildung 2.17). Dies steht im

Einklang mit der gegenüber der Reinigung der ROL aus Pichia pastoris (kultiviert in

komplexem Medium) verminderten spezifischen Aktivität von 3290 U mg

-1

Deshalb wurde untersucht, ob durch Chromatographie auf Grund hydrophober Wechselwir-

kungen (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) eine weitere Aufreinigung zu er-

reichen war.

66 kDa

45 kDa

31 kDa

21 kDa

14 kDa

Abbildung 2.17: SDS PAGE der ROL aus Pichia pastoris kultiviert in synthetischem

Medium.

S Standard; 1 ROL-Überstand 2 ROL gereinigt mit SP-Sepharose.

Da über die Eigenschaften der ROL für die HIC keine Daten aus der Literatur vorlagen,

wurde zuerst Phenylsepharose verwendet, das bei der Ausbildung von hydrophoben Wech-

selwirkungen zwischen Octylsepharose (stärkere Wechselwirkung) und Butylsepharose

(schwächere Wechselwirkung) liegt. Da bei der Kationenaustauschchromatographie 1 M

NaCl als Elutionspuffer verwendet wurde, bot sich dieser Puffer als Auftragungs- und

Äquilibrierungspuffer für die HIC an.

Bei der Reduktion der Salzkonzentration von 1 M NaCl auf reines Wasser durch einen linea-

ren Gradienten zur Elution konnte mit dem pNPP-Test keine Lipaseaktivität in einer der ge-

sammelten Fraktionen nachgewiesen werden, obwohl im Schreiberprotokoll des UV/VIS-

Detektors ein Signal auftrat (ohne Abbildung). Daraufhin wurden verschiedene Detergentien

1 2 ... 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 ... 152 153

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